低血糖的診斷：大多數低血糖見於胰島素或磺脲類藥治 療病人或新近飲酒者，診斷一般沒有困難最初監測包括對不能解釋的意識損害（或癫痫）病人進行快速血糖測定。若有異常低血糖，應立即推注葡萄糖（見下文治療）。隨著血糖升高，中樞神經症狀迅速緩解（見於大多數病人），可確診為饑餓性低血糖和藥物誘導低血糖。第一份血標本的一部分應以冰凍血漿保存，可用來測定血漿胰島素，胰島素原及C-肽水平，需要時可作藥物監測。應測定血乳酸，pH和血酮。
無論病人出現不能解釋的中樞神經系統症狀，還是不能解釋的交感神經症狀，確診時需要證據表明這些症狀與低血糖異常有關，並且血糖升高後症狀好轉。異常低血糖診斷標准通常為：男＜50mg/dl（＜2.78mmol/L），女＜40mg/dl（＜2.5mmol/L）（饑餓72小時後正常男性，女性最低值），嬰兒和兒童＜40mg/dl（2.22mmol/L）（參見第260節）。
實驗室檢查可鑒別不同病因。胰島素分泌胰腺腫瘤病人（胰島素瘤，胰島細胞癌）常有胰島素原和C-肽與胰島素平行增加。服用磺脲類藥物病人，C-肽水平應升高，血中藥物濃度亦應升高。外源性胰島素誘發低血糖病人（常為糖尿病病人的家屬或服務人員），胰島素原正常，C-肽水平下降。罕見的自身免疫低血糖病人，在低血糖發作期間，血漿游離胰島素明顯升高，血漿C-肽受抑，易檢測到血漿胰島素抗體。自身免疫性低血糖與偷用胰島素引起的低血糖的鑒別需要特殊研究。
胰島素瘤與其他原因的饑餓性低血糖的區別在於，經常出現的突發意識模糊或喪失，在年病程中發作可變得更頻繁。發作特點是進食超過6小時後或過夜空腹後發作，有時鍛煉促發（如早餐前快速步行）。可自發緩解，常有病人攝入液體或糖類後病情好轉的病史。血漿胰島素水平升高[＞6μu/ml（＞42pmol /L）]伴低血糖，若排除偷用磺脲藥和胰島素時，則有利於提示胰島素瘤存在。
若陣發性中樞神經系統症狀的其他病因不明顯，病人可住院作饑餓試驗（fasttest），監測其血糖，胰島素，胰島素原，C-肽水平。79%的胰島素瘤病人在48小時內出現症狀，而98%的胰島素瘤病人在72小時內出現症狀。若饑餓可重新出現症狀，給予葡萄糖時迅速好轉，在症狀出現時伴有異常低血糖和異常高胰島素血症，則可確診胰島素分泌腫瘤。其他診斷方法（如靜脈推注甲磺丁脲）只在有使用經驗的咨詢中心進行，很少采用。一般來說，胰島素瘤極小，標准X線或CT難以探及。擬診病人在術前應去咨詢中心，由經驗豐富的醫生作評估。
低血糖的診斷：飲食性低血糖症只應考慮有胃腸道手術史的病人，其餐後腎上腺素能症狀可被選擇性攝入碳水化合物而緩解。可通過家庭血糖監測來評估症狀和血糖間關系（如餐後1,2小時及每當症狀出現時測血糖）。口服糖耐量試驗（OGTT）不是診斷飲食性低血糖症的可靠方法。
