房間隔缺損的診斷據典型的體征和實驗室檢查結果，診斷並不困難，但需與以下情況鑒別。
鑒別診斷
(一)、本病體征不很明顯的病人需與正常生理情況相鑒別：
如僅在胸骨左緣第2肋間聞及2級吹風樣收縮期雜音，伴有第二心音分裂或亢進，則在正常兒童中亦常見到，此時如進行X線，心電圖，超聲心動圖檢查發現有本病的征象，才可考慮進一步做右心導管檢查等確診。
(二)、較大的心室間隔缺損：
因左至右的分流量大，其X線，心電圖表現與本病可極為相似，體征方面亦可有肺動脈瓣區第二心音的亢進或分裂，因此可能造成鑒別診斷上的困難。
但室間隔缺損雜音的位置較低，常在胸骨左緣第3，第4肋間，且多伴震顫，左心室常有增大等可資鑒別，但在兒童病人，尤其是與第一孔未閉型的鑒別仍然不易，此時超聲心動圖，右心導管檢查等有助於確立診斷。
此外，左心室-右心房溝通(一種特殊類型的心室間隔缺損)的病人，其體征類似高位心室間隔缺損，右心導管檢查結果類似心房間隔缺損，也要注意鑒別。
(三)、瓣膜型單純肺動脈口狹窄：
其體征，X線和心電圖的表現，與本病有許多相似之處，有時可造成鑒別上的困難，但瓣膜型肺動脈口狹窄時，雜音較響，常伴有震顫，而肺動脈瓣區第二心音減輕或聽不見;
X線片示肺野清晰，肺紋稀少，可資鑒別，超聲心動圖見肺動脈瓣的異常，右心導管檢查發現右心室與肺動脈間有收縮期壓力階差，而無分流的證據，則可確診。
(四)、原發性肺動脈高壓：
其體征和心電圖表現，與本病頗為相似;X線檢查亦可發現肺動脈總干弧凸出，肺門血管影增粗，右心室和右心房增大;但肺野不充血或反而清晰，可資鑒別，右心導管檢查可發現肺動脈壓明顯增高而無左至右分流的證據。
